H2IntroduccióH/2PL’enginyeria del teixit ossi té com a objectiu reparar o substituir l’os danyat o malalt mitjançant una combinació de cèl·lules, bastides i molècules bioactives. Aquest estudi se centra a desenvolupar un mètode immunohistoquímic (IHC) per identificar i localitzar osterix, un factor de transcripció clau implicat en la formació òssia, en construccions d’enginyeria de teixits compostes per periosti humà, nanofibres electrospun d’àcid poli-l-làctic (PLLA) i policaprolactona. Bastides d’àcid poli-l-làctic (PCL/PLLA).P/H2Materials i mètodesH/2H3Exemplars de teixitH/3PEs van obtenir mostres de teixit a partir de construccions òssies dissenyades per teixits creades amb teixit periòstic humà, nanofibres PLLA i bastides PCL/PLLA. Les construccions es van implantar per via subcutània en ratolins atímics durant 10 setmanes, permetent la regeneració dels teixits.P/H3Seccionament i preparació inicial de la diapositivaH/3PDesprés de la recuperació, les construccions es van fixar en formalina, es van incrustar en parafina i es van seccionar. Les seccions es van desparafinar, es van rehidratar i es van sotmetre a procediments de recuperació d’antigen.P/H3Recuperació d’epítops induïts per proteasesH/3PEs va intentar la recuperació d’epítops induïda per proteases (PIER) utilitzant col·lagenasa tipus 1, pronasa i una barreja d’ambdues. Tanmateix, cap d’aquests mètodes va revelar amb èxit l’epítop d’osterix.P/H3Recuperació d’epítops induïts per la calorH/3PLa recuperació d’epítops induïda per calor (HIER) es va realitzar utilitzant diversos tampons i temperatures. Inicialment, la temperatura alta (120 ° C) i la pressió (15 psi) en un autoclau van donar resultats positius, però van causar danys en els teixits i la delaminació de la secció. Posteriorment, es va trobar que HIER utilitzant tampó citrat de sodi / EDTA / Tween 20 a 60 ° C i pressió normal (15 psi) durant 72 hores recuperava eficaçment l’epítop d’osterix tot preservant la integritat del teixit.P/H3Etiquetatge d’anticossos OsterixH/3PDesprés de la recuperació de l’epítop, les seccions es van incubar amb un anticòs primari específic per a l’osterix humà. Es va determinar que una dilució d’1:50 era òptima per a la unió d’anticossos.P/H2ResultatsH/2H3Optimització del protocol IHCH/3PEs va trobar que HIER utilitzant tampó citrat de sodi / EDTA / Tween 20 a 60 ° C i pressió normal durant 72 hores era el mètode més eficaç per a la recuperació de l’epítop d’osterix tot preservant l’estructura del teixit.P/H3Localització de cèl·lules positives d’OsterixH/3PLa tinció d’IHC va revelar cèl·lules positives d’Osterix dins del teixit periòstic, nanofibres de PLLA electrospun i bastides PCL/PLLA subjacents de les construccions d’enginyeria de teixits. Això indica que els osteoblasts derivats del periosti havien migrat dins i a través de la capa de nanofibres.P/H2DiscussióH/2PEl desenvolupament reeixit d’un mètode IHC per a la identificació i localització d’osterix en construccions òssies d’enginyeria de teixits proporciona una eina valuosa per avaluar la viabilitat i el potencial osteogènic d’aquestes construccions. El protocol HIER optimitzat que utilitza tampó citrat de sodi/EDTA/Tween 20 a 60 ° C i pressió normal durant 72 hores revela de manera eficaç l’epítop d’osterix alhora que preserva la integritat del teixit.P/PLa presència de cèl·lules positives d’Osterix dins de la capa de nanofibra suggereix que els osteoblasts poden migrar a través d’aquesta capa, cosa que podria facilitar la formació òssia i la integració de la construcció amb el teixit circumdant.P/PAquest estudi destaca la importància d’optimitzar els protocols IHC per a proteïnes i tipus de teixit específics, especialment quan es tracta d’exemplars complexos que contenen tant teixits com materials sintètics. El protocol optimitzat desenvolupat aquí es pot aplicar per investigar més el paper de l’osterix en la regeneració òssia i per avaluar l’eficàcia de les construccions d’enginyeria de teixits per a la reparació òssia.P/H2AgraïmentsH/2PEls autors reconeixen les contribucions de la Dra. Susan Chubinskaya, la Xarxa de Donants d’Òrgans i Teixits Gift of Hope i les famílies donants per oferir accés a mostres de teixits.P/H2Notes a peu de pàginaH/2PInteressos en competència: els autors no declaren interessos en competència.P/PContribucions de l’autor: PM va dissenyar l’estudi, va realitzar els experiments IHC, va analitzar les dades i va escriure el manuscrit. RJ va dissenyar l’estudi, va analitzar les dades i va escriure el manuscrit. QY va realitzar els experiments IHC, va analitzar les dades i va escriure el manuscrit. WJL va dissenyar l’estudi, va analitzar les dades i va escriure el manuscrit. Tots els autors van llegir i van aprovar el manuscrit final.P/PFinançament: no s’ha rebut cap finançament per a aquest estudi.P/
35
