H2IntroducciónH/2PLa ingeniería del tejido óseo tiene como objetivo reparar o reemplazar el hueso dañado o enfermo utilizando una combinación de células, andamios y moléculas bioactivas. Este estudio se centra en el desarrollo de un método inmunohistoquímico (IHC) para identificar y localizar osterix, un factor de transcripción clave implicado en la formación ósea, en construcciones de ingeniería tisular compuestas de periostio humano, nanofibras electrohiladas de ácido poli-l-láctico (PLLA) y policaprolactona. /andamios de ácido poli-l-láctico (PCL/PLLA).P/H2Materiales y métodosH/2H3Muestras de tejidoH/3PSe obtuvieron muestras de tejido a partir de construcciones óseas diseñadas mediante ingeniería tisular creadas con tejido perióstico humano, nanofibras de PLLA y armazones de PCL/PLLA. Las construcciones se implantaron por vía subcutánea en ratones atímicos durante 10 semanas, lo que permitió la regeneración del tejido.P/H3Seccionamiento y preparación inicial de portaobjetosH/3PDespués de la recuperación, las construcciones se fijaron en formalina, se incluyeron en parafina y se seccionaron. Las secciones se desparafinaron, se rehidrataron y se sometieron a procedimientos de recuperación de antígenos.P/H3Recuperación de epítopos inducida por proteasaH/3PSe intentó la recuperación de epítopos inducida por proteasa (PIER) utilizando colagenasa tipo 1, pronasa y una mezcla de ambas. Sin embargo, ninguno de estos métodos reveló con éxito el epítopo de osterix.P/H3Recuperación de epítopos inducida por calorH/3PLa recuperación de epítopos inducida por calor (HIER) se realizó utilizando diversos tampones y temperaturas. Inicialmente, la temperatura alta (120 °C) y la presión (15 psi) en un autoclave produjeron resultados positivos, pero causaron daño al tejido y delaminación de la sección. Posteriormente, se descubrió que HIER utilizando citrato de sodio/EDTA/tampón Tween 20 a 60 °C y presión normal (15 psi) durante 72 horas recuperaba eficazmente el epítopo de osterix preservando al mismo tiempo la integridad del tejido.P/H3Etiquetado de anticuerpos OsterixH/3PDespués de la recuperación del epítopo, las secciones se incubaron con un anticuerpo primario específico para osterix humano. Se determinó que una dilución de 1:50 era óptima para la unión del anticuerpo.P/H2ResultadosH/2H3Optimización del protocolo IHCH/3PSe descubrió que HIER, que utiliza citrato de sodio/EDTA/tampón Tween 20 a 60 °C y presión normal durante 72 horas, es el método más eficaz para la recuperación del epítopo de Osterix preservando al mismo tiempo la estructura del tejido.P/H3Localización de células positivas para OsterixH/3PLa tinción IHC reveló células positivas para Osterix dentro del tejido perióstico, nanofibras de PLLA electrohiladas y armazones de PCL/PLLA subyacentes de las construcciones diseñadas con tejidos. Esto indica que los osteoblastos derivados del periostio habían migrado hacia y a través de la capa de nanofibras.P/H2DiscusiónH/2PEl desarrollo exitoso de un método IHC para la identificación y localización de osterix en construcciones óseas obtenidas mediante ingeniería tisular proporciona una herramienta valiosa para evaluar la viabilidad y el potencial osteogénico de estas construcciones. El protocolo HIER optimizado que utiliza tampón citrato de sodio/EDTA/Tween 20 a 60 °C y presión normal durante 72 horas revela eficazmente el epítopo de osterix al tiempo que preserva la integridad del tejido.P/PLa presencia de células positivas para Osterix dentro de la capa de nanofibras sugiere que los osteoblastos pueden migrar a través de esta capa, lo que podría facilitar la formación de hueso y la integración de la construcción con el tejido circundante.P/PEste estudio destaca la importancia de optimizar los protocolos IHC para proteínas y tipos de tejidos específicos, especialmente cuando se trata de muestras complejas que contienen tejido y materiales sintéticos. El protocolo optimizado desarrollado aquí se puede aplicar para investigar más a fondo el papel de osterix en la regeneración ósea y evaluar la eficacia de las construcciones de ingeniería tisular para la reparación ósea.P/H2Expresiones de gratitudH/2PLos autores agradecen las contribuciones de la Dra. Susan Chubinskaya, la Red de Donantes de Órganos y Tejidos Gift of Hope y las familias de donantes por brindar acceso a muestras de tejido.P/H2Notas a pie de páginaH/2PIntereses en competencia: Los autores no declaran intereses en competencia.P/PContribuciones del autor: PM diseñó el estudio, realizó los experimentos IHC, analizó los datos y escribió el manuscrito. RJ diseñó el estudio, analizó los datos y escribió el manuscrito. QY realizó los experimentos IHC, analizó los datos y escribió el manuscrito. WJL diseñó el estudio, analizó los datos y escribió el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.P/PFinanciamiento: No se recibió financiamiento para este estudio.P/
11
